Inspirerend, verbindend en nieuwsgierig
Een leven lang leren

BIOP 2020- 2021

Praktijk periode 2
    2 hoofdlijnen

  • TK 6: Op basis van de Alkalische fosfatase bepaling AF1 en AF2
  • TK 7: Op basis van AF3
  • TK 8: Op basis van Alkalische fosfatase en glucose
  • Kennismaken met DNA -technieken in de praktijk
                           DNA isoleren uit thymus en zuiverheid bepalen
                           DNA digesteren en electroforeren 
1 / 36
volgende
Slide 1: Tekstslide
BiologieMBOStudiejaar 2

In deze les zitten 36 slides, met tekstslides en 2 videos.

time-iconLesduur is: 45 min

Onderdelen in deze les

Praktijk periode 2
    2 hoofdlijnen

  • TK 6: Op basis van de Alkalische fosfatase bepaling AF1 en AF2
  • TK 7: Op basis van AF3
  • TK 8: Op basis van Alkalische fosfatase en glucose
  • Kennismaken met DNA -technieken in de praktijk
                           DNA isoleren uit thymus en zuiverheid bepalen
                           DNA digesteren en electroforeren 

Slide 1 - Tekstslide

Deze slide heeft geen instructies

Op te leveren producten vanuit Digibib
  • Glucose: VB, MR en Rapportage met controlekaart           (TK7b TK8a en 8c)  
  • AF 1: VB, MR 
  • AF 1: TK6a 
  • AF 2: VB op basis van TK6a  en uitwerking volgens TK6c
  • AF 3: TK 7a en 7b, TK 8a en 8c

Slide 2 - Tekstslide

Deze slide heeft geen instructies

H6.1: Inleiding enzymen
enzym
Substraat
De stof die omgezet wordt in een (bio)chemische reactie
Product
De stoffen die ontstaan bij een (bio)chemische reactie

Slide 3 - Tekstslide

Deze slide is gewoon een algemeen plaatje. 
  • Even aangeven dat de cartoon een chemische reactie is. 
  • Dat het enzym de omzetting mogelijk maakt en zelf niet wordt verbruikt = katalysator
  • Dan gelijk naar de volgende slide met filmpje.

Slide 4 - Video

Deze slide heeft geen instructies

Activeringsenergie
  • Om een reactie te laten verlopen is energie nodig (rood)
  • Een katalysator verlaagd deze hoeveelheid energie (blauw)
  • Daardoor verloopt de reactie makkelijker en dus sneller. 

Slide 5 - Tekstslide

Wederom samenvatten: 
  • Een katalysator verlaagd de activeringsenergie
  • De reactie verloopt daardoor makkelijker en sneller
  • Worden zelf niet verbruikt
  • In de biologie heten deze katalysatoren ENZYMEN genoemd


6.2: Werking van enzymen
Wat zijn enzymen:
  • Eiwitten (zie H5.4)
  • Bezitten een ruimtelijke structuur (vouwing; H5.4.4)
  • Deze structuur is van groot belang voor de werking
  • Zijn biologisch actief: Versnellen een biochemische reactie
  • Worden zelf niet verbruikt tijdens de reactie
  • Hebben een co-factor/ enzym nodig om goed te kunnen werken
Co-factor of co-enzym
  • Is een hulpstof die bijdraagt aan de juiste ruimtelijke structuur van het enzym (eiwit).
  • Meestal zijn dit vitaminen of metaal-ionen 
(micro-nutriënten H14.3.2)

Slide 6 - Tekstslide

Deze slide heeft geen instructies

Slide 7 - Video

Deze slide heeft geen instructies

6.3: Invloed van de temp. op enzymen
Algemeen:
Als de temperatuur stijgt, gaan reacties sneller 
  • Maar is dit bij enzymen ook het geval? 

Slide 8 - Tekstslide

Namen van ingelogde studenten komen in het wiel te staan. 
Door te draaien krijgt iemand een beurt om antwoord te geven op de vraag. 
Bij verhoging van de temperatuur stijgt de reactiesnelheid, maar niet onbeperkt. Leg uit. 
Minimumtemperatuur
De laagste temp. waarbij het enzym nog actief is
Optimumtemperatuur
Is de temp. functioneerd het enzym het best. 

Maximumtemperatuur
De hoogste temp. waarbij een enzym nog actief is. Boven deze temp. is het enzym niet meer actief. Eiwitten denatureren bij hoge temp. 

Slide 9 - Tekstslide

Verwijs eventueel naar de praktijk. 

6.4: Invloed van de zuurgraad op enzymen
Eiwitten: 
  • Hebben een ruimtelijke structuur.
  • Wordt bepaald door de rangschikking van de aminozuren
  • De zuurgraad heeft invloed op de restgroepen
  • Dus ook op de ruimtelijke structuur en de activiteit van het enzym


Slide 10 - Tekstslide

Verwijs eventueel op de praktijk
Invloed van de zuurgraad op het enzym  vergelijkbaar met de invloed van de temperatuur op het enzym

Slide 11 - Tekstslide

Deze slide heeft geen instructies

Optimale omstandigheden voor enzymen
  • In ons lichaam is 37C de optimale temp voor de enzymen

  • Het optimum voor de pH is bij elk enzym verschillend

  • Dit hangt voornamelijk af van de locatie in het lichaam

Slide 12 - Tekstslide

Na slide 48 opgave 9 t/m 17 pagina 116 en 117
Alkalische fosfatase (AF)
Op basis van ingeleverde producten
  • Activiteit vs concentratie
  • Berekeningen: Betrouwbaarheidsinterval Bijlage 7 
  • Resultaten: tabellen staat een voorbeeld op pagina 7
  • Opstellen ijklijn: Rekenvel is ter ondersteuning. 
  • Trekken van conclusies

Slide 13 - Tekstslide

Deze slide heeft geen instructies

Betrouwbaarheidsinterval
Bijlage 7 praktijkbundel
Activiteits vs concentratie
De activiteit van een enzym wordt uitgedrukt in units per liter (U/l). Eén U/l komt overeen met een reactiesnelheid waarbij de productconcentratie per minuut met 1 µmol/l toeneemt.

Concentratie is een hoeveel stof opgelost in een vloeistof

Slide 14 - Tekstslide

Deze slide heeft geen instructies

Berekening ijklijn
Stockstandaard p-nitrofenol
Los 0,0940 g p-nitrofenol (0,75 mmol/l) op in 0,1M NaOH tot 1000ml. De standaard komt overeen met een AF activiteit van 5000U/L. 
Wat wil dit zeggen? 
Wat is p-nitrofenol in dit voorschrift? 
Hoe worden de assen van de ijlijn genoemd? 

Slide 15 - Tekstslide

Deze slide heeft geen instructies

Trekken van conclusies.
- Acceptabele bepalingsblanco? In dit voorschrift NVT. Waarom? 
- Acceptabele duploverschillen?
- Uitslag controlemonster valt in het betrouwbaarheidsinterval?
- R2 kalibratiecurve acceptabel (R2 > 0,995)?

Mogen de uitslagen worden doorgegeven?

Zie ook pagina 7

Slide 16 - Tekstslide

Deze slide heeft geen instructies

Conclusie na het nakijken van de Meetrapporten
Veel onnodige fouten door niet goed lezen
* Begrijpend lezen? 
* Veel nuttige aanwezig informatie gemist. 
  Die wel voorhanden was in het voorschrift
Samenwerking in de groep loopt niet goed.

TIP: Reserveer een moment waarop jullie elkaar treffen in teams. 

Slide 17 - Tekstslide

Deze slide heeft geen instructies

DNA technieken periode 6
  • DNA islolatie Thymus, zuiverheids en concentratiebepaling
  • DNA digestie (knippen) en agarosegel electroforese

Deze experimenten zullen door elkaar lopen. 
Belangrijk is om dit uit elkaar te houden. 

Slide 18 - Tekstslide

Deze slide heeft geen instructies

DNA isolatie Kalfsthymus
DNA digestie en electroforese
Week 2.5
DNA isolatie
Gieten agarosegel
Week 2.7
Digestie inzetten
Week 2.8
Conc. + zuiverheid
Electroforese
Planning uitvoering DNA technieken periode 6

Slide 19 - Tekstslide

Deze slide heeft geen instructies

DNA isolatie uit kalfsthymus
Voorbehandeling
Analyse
Isolatie
UV- spectrofotometrie
Zuiverheid/ concentratie
Week 2.5
Week 2.8

Slide 20 - Tekstslide

Deze slide heeft geen instructies

DNA digestie en electroforese
Digestie
Electroforese
Voorbehandeling
Analyse

Slide 21 - Tekstslide

Deze slide heeft geen instructies

DNA isolatie uit kalfsthymus
Vraag 1: Waar in het protocol wordt zeep gebruikt? 
Vraag 2: Wanneer komt het DNA vrij? 
Vraag 3: Waar wordt dit door veroorzaakt? 
Vraag 4: Wat is de functie van TE-buffer? 

Slide 22 - Tekstslide

Deze slide heeft geen instructies

DNA digestie (knippen)
ʎ DNA
  • Enzymen EcoRI  of HindIII
Restrictiemap
Electroforese patroon
Op een dergelijk wijze kan ook een voorspelling voor pUC19 gemaakt worden

Slide 23 - Tekstslide

Deze slide heeft geen instructies

DNA digestie mix berekening
ʎ DNA (0,33 µg/µl)
pUC19 (0,5µg/µl)
1µg DNA  =..............µl

2µl 10x buffer

2µl enzym

?? µl AD=................µl
1µg DNA =..............µl

 2µl 10x buffer

2µl enzym

?? µl AD=................µl
Totaal 20µl
Totaal 20µl

Slide 24 - Tekstslide

Deze slide heeft geen instructies

Aandachtspunten inzetten digestie
  • Pipetteren restrictie-enzymen 
  • Restrictie-enzymen op ijs
  • Labeling epjes 

Slide 25 - Tekstslide

Deze slide heeft geen instructies

Indien er geen antilichaam tegen het HbsAg aanwezig is, kan er geen substraat worden omgezet in een gekleurd product. 
ELISA: aantonen HbsAg antilichamen
Het HbsAg is een eiwit afkomstig van het hepatitis B virus. Als een persoon geinfecteerd geraakt met dit virus, dan zal deze persoon tegen dit lichaamsvreemde eiwit antistoffen aanmaken. 
Deze antistoffen kunnen ook worden aangetoond na vaccinatie tegen HepB. 

Slide 26 - Tekstslide

Deze slide heeft geen instructies

Aanpassingen voorschrift
Jullie krijgen geen 10% Tween-20, maar 100%.
Oorspronkelijk was:
0,5 ml 10% Tween-20 

PBS
Maak nu eerst een voorverdunning van 10% Tween-20
  • Wasbuffer

Slide 27 - Tekstslide

Deze slide heeft geen instructies

Aanpassingen voorschrift
Jullie krijgen geen 100 g/L, maar 70 g/L
Oorspronkelijk was:
0,4 ml BSA (100 g/L) 

2 ml wasbuffer
Dit wordt: 0,6 ml BSA (70 g/L)
  • Blockbuffer
2 ml wasbuffer

Slide 28 - Tekstslide

Deze slide heeft geen instructies

Digestie van Lambda DNA en pUC19 en Electroforese
ʎ DNA (0,33 µg/µl)
pUC19 (0,5µg/µl)
1µg DNA  =..............µl

2µl 10x buffer

2µl enzym

?? µl AD=................µl
1µg DNA =..............µl

 2µl 10x buffer

2µl enzym

?? µl AD=................µl
Totaal 20µl
Totaal 20µl

Slide 29 - Tekstslide

Deze slide heeft geen instructies

DNA digestie en electroforese
Digestie
Electroforese
Voorbehandeling
Analyse

Slide 30 - Tekstslide

Deze slide heeft geen instructies

Concentratie bepalen en zuiverheid Thymus DNA
Concentratie
  • Meting bij 260mn: UV spectrofotometrie/ speciale cuvetten
Zuiver DNA: extinctie van 1.000 komt overeen met 50ug/ ml
E=ϵlc
Bereken de ϵ van zuiver DNA
ϵ=clE
ϵ=501=0,02ug1cm1ml

Slide 31 - Tekstslide

Deze slide heeft geen instructies

Concentratie Thymus DNA
Bereken de concentratie 
c=ϵlE
c=0,02Egecorrvf

Slide 32 - Tekstslide

Deze slide heeft geen instructies

Concentratie Thymus DNA
Welke vloeistof zit er in cuvet 1: Water
Welke vloeistof zit er in cuvet 2: TE
Welke vloeistof zit er in cuvet 5: Thymus DNA opgelost in TE
Welke vloeistof zit er in cuvet 3: Haring DNA opgelost in TE
Welke vloeistof zit er in cuvet 4: BSA opgelost in TE
Meten bij 260nm

Slide 33 - Tekstslide

Deze slide heeft geen instructies

Zuiverheid bepalen Thymus DNA
Welke vloeistof zit er in cuvet 1: Water
Welke vloeistof zit er in cuvet 2: TE
Welke vloeistof zit er in cuvet 3: Haring DNA opgelost in TE
Welke vloeistof zit er in cuvet 4: BSA opgelost in TE
Welke vloeistof zit er in cuvet 5: Thymus DNA opgelost in TE
Meten bij 280nm

Slide 34 - Tekstslide

Deze slide heeft geen instructies

Zuiverheid Thymus DNA
Bereken de zuiverheid 
Zuiver DNA: E260 gecorr/ E280 gecorr = 1,8
Zuiver RNA: E260 gecorr/ E280 gecorr = 2,0
Zuiver Eiwit: E260 gecorr/ E280 gecorr = 0,6 
ʎmax: nucleinezuren bij 260nm
ʎmax: eiwit bij 280nm

Slide 35 - Tekstslide

Deze slide heeft geen instructies

Waarmee wordt de betrouwbaarheid van deze meting gecontroleerd? 
1: 
2: 
Tip voor meetrapport: Denk goed na over de resultatentabel

Slide 36 - Tekstslide

Deze slide heeft geen instructies