T4B2 - DNA-replicatie

• Biologie
• Middelbare school
• vwo
• Leerjaar 5

T4B2 - DNA-replicatie

Leerdoelen

1. 10.2.1 Je kunt uitleggen hoe DNA-replicatie plaatsvindt.
   
2. 10.2.2 Je kunt uitleggen hoe de basenvolgorde van DNA kan worden bepaald.
   
3. 10.2.3 Je kunt uitleggen hoe DNA-analyse kan worden toegepast om verwantschap tussen organismen vast te stellen.

Begrippen BS2

S-fase

DNA-replicatie

helicase

replicatiebel

primer

DNA-polymerase

afleesrichting

leidende streng

Okazaki-fragmenten

DNA-ligase

volgende streng

telomeer

PCR

sequencen

gelelectroforese 

DNA-fingerprint

restrictie enzymen

Celdeling

Door middel van celdeling maak je van een cel een identieke dochter cel. Deze cel moet dus ook hetzelfde DNA hebben.

Celdeling start dus ook altijd met het kopieren van DNA, ook wel replicatie genoemd.

DNA-replicatie vindt plaats tijdens de S-fase

(binas tabel 71D)

 

Bouw van DNA

Nucleotide = suiker + fosfaat + base 

'5 uiteinde: een fosfaatgroep

'3 uiteinde: een OH-groep

Leesrichting: 3' naar 5'

(DNA polymerase van 5' naar 3')

  stap 1            

1. Waterstofbruggen van de        basenparen worden vanaf        replicatiestartpunt in twee        richtingen verbroken door        enzym helicase.

2. Ds-DNA wordt ss-DNA.

3. Hierdoor ontstaat een              replicatiebel.                          

-> replicatiebel 

stap 2

Single-strand DNA-binding proteins (SSBP's) binden aan het ssDNA, zodat de H-bruggen niet worden hersteld 

stap 3

De primer hecht aan het ssDNA aan de 3' kant.

• primers worden door het enzym primase gemaakt 
• primer is aanhechtingspunt voor DNA-polymerase, want DNA-polymerase kan alleen nucleotiden kan vastplakken aan het 3’-uiteinde

DNA-polymerase

• werkt vanaf de 3'-kant
• vanaf 3' kant primer worden dNTPs (deoxynucleotidetrifosfaat) toegevoegd. 
• Hiervoor wordt energie gebruikt door splitsen van 2 fosfaatgroepen.
• dAMP, dTMP, dGMP, dCMP

DNA replicatie

Afleesrichting DNA polymerase: 3' naar 5' uiteinde

Nieuwe streng wordt gemaakt in richting 5' naar 3' uiteinde.

Nucleotide bindt dus aan 3' uiteinde

DNA-polymerase

• In een replicatiebel wordt het dubbelstrengs DNA in twee richtingen opengeritst (A). 

• Leading streng (leidende streng): DNA-polymerase kan aaneensluitend nucleotiden toevoegen.

• Lagging streng (volgende streng) DNA-polymerase kan steeds maar korte stukje DNA (okazaki-fragmenten) maken vanaf een primer, omdat dit achterwaarts gebeurd (wachten op  helicase).

Lagging strand

in de andere richting wordt er gebruik gemaakt van Okazaki-fragmenten

• kleine stukjes DNA die worden ingebouwd 
• stukjes worden door        DNA ligase aan elkaar gemaakt

Na replicatie bestaat een chromosoom uit 2 chromatiden (een nieuwe en een oude).

Tijdens mitose gaan chromatiden uit elkaar.

Elke dochtercel zal dan ook voor de helft uit het DNA van de origenele cel bestaan

Telomeren en veroudering

RNA-primer uiteinde DNA-streng wordt verwijderd.

Hierdoor kan het uiteinde van een enkelvoudige DNA-keten niet worden gerepliceerd, en wordt verwijderd.

• Het DNA-molecuul wordt korter.

Om DNA-schade te voorkomen bezitten de uiteinde van chromosomen: telomeren.

Telomeer

• niet-coderend DNA
  
• beschermd de uiteinde 
  
• repeterend: 5' TTAGGG 3'
• na elke celdeling korter
• bij geboorte 11000 
• na 50 delingen 1/5 over
• bepaald levensduur van organisme 

Aan de slag!

Wat:	Maak van basisstof 2: opdracht 14 t/m 19
Hulp nodig:	zoek het op in je BINAS of in je boek
Uitkomst:	we bespreken de vragen met elkaar

Aan de slag!

DNA technieken

1. PCR - polymerase chain reaction
2. Sequencen
3. gelelectroforese (en restrictieenzymen) 
4. DNA-fingerprinting

PCR:polymerase chain reaction

• DNA uit cellen (of moordonderzoek) is vaak te weinig voor onderzoek.
• DNA replicatie
  
• 3 stappen (denatureren 94*C)/ hybridiseren (52*C)/ aangroei (72*C))
  
• warmte bestendige polymerase
  
• Wat moet je allemaal toevoegen aan het PCR cycler?

PCR:polymerase chain reaction

nodig:

• PCR machine
• forward en reverse

    primers 20-30 nucleotiden 

• DNA-nucleotiden
• DNA-polymerase
• DNA template 

PCR

herhaling stappen tot wel 40 keer. herhaling stappen tot wel 40 keer tot er genoeg materiaal is om te analyseren

- DNA-NTPs kunnen opraken

1.  dsDNA smelten zodat er ssDNA ontstaat -> 95 *C
2. primers hechten -> 65 *C
3. DNA-polymerase synthetiseert het nieuwe DNA -> 72*C

Sanger sequencing

• Eerst DNA-vermenigvuldigen 

1. Denaturatie DNA (95*C)
2. Primer (95*C)
3. DNA polymerase maakt nieuwe keten (72*C)

• Vervolgens 4 PCR-reacties, waarbij je bij elke reactie een kleine hoeveelheid van één specifiek ddNTP toevoegt (ddA, ddT, ddG, ddC) 

• ddNTPs, missen OH-groep zodat de replicatie stopt en er fragmenten van verschillende grote ontstaan.

Fragmenten van verschillende grootte

5’ - CGTAGCTATCGA** - 3’ (DNA-sequentie)

CGTA → kort fragment (laag in de gel, snel gemigreerd)

CGTAGCTA → langer fragment (hoger in de gel, trager gemigreerd)

CGTAGCTATCGA → nog langer fragment (nog hoger in de gel) 

Gelelektroforese

Elektroforese scheidt de fragmenten op lengte.

DNA is negatief. 

Door spanning migreren DNA fragmenten naar positieve pool

Hoe kleiner hoe makkelijker de fragmenten door de gel migreren  

Gelelektroforese

De kortste fragmenten (die vroeg stoppen) bewegen het snelst door de gel en bevinden zich onderaan.

Aflezen volgorde

De kleinste fragmenten (onderaan in de gel) geven de eerste base van de sequentie aan.

De volgende fragmenten geven de daaropvolgende bases aan.

Door de banden van onder naar boven te lezen, bepaal je de complementaire DNA-volgorde.

Sanger sequencing en gelelektroforese

Sanger sequencing en gelelektroforese

DNA-fingerprinting

• het niet coderende DNA bevat veel herhalingen (repeterende fragmenten)
  
• hoe vaak zo'n stukje wordt herhaald is uniek per persoon
  
• kan verschillen tussen de chromosomen
• net zo uniek als een vingerafdruk
• Voor DNA-profiel worden beide allelen van                          minimaal 10 loci met repetitief DNA onderzocht.

DNA-fingerprinting

• Voor analyse wordt DNA eerst vermeerderd (met PCR) en vervolgens knipt men de loci met repeats uit DNA.
• Gebeurt met restrictieenzymen afkomstig uit bacteriën.
• Enzymen die stukjes van 4-8 nucleotiden kunnen herkennen en vervolgens het DNA daar knippen
  
• gebruikt in de researchlab's op PCR fragmenten voor het kloneren, samenstellen van genen
  

DNA-profiel 

• Verwantschap familie
• Forensisch onderzoek

Welke man (man 1, 2 of 3) 

is de vader van het kind?

Wie heeft zijn DNA achtergelaten 

op plaats delict?

Wie heeft zijn DNA achtergelaten 

op plaats delict?

Aan de slag!

Wat:	Maak van basisstof 2: opdracht 20 t/m 26
Hulp nodig:	zoek het op in je BINAS of in je boek
Uitkomst:	we bespreken de vragen met elkaar
Klaar?	Lees basisstof 3

Aan de slag!