Presentatie 24h-ECP

• Biologie
• WO
• Studiejaar 2

Assesment of ischemia reperfusion related alterations in porcine muscle

Nikki te Lintelo

Medical Biology

Introductie

• Vascularized Composite Allografts (VCA's)
• Gelimiteerde ischemie-tijd spier
• Preservatie ledematen
• 4h-SCS vs. 24h-ECP 
• Visualisatie histologie
• HE: tijd & sensitiviteit
• NADH, MAC

'How can ischemia reperfusion related alterations be reduced in muscle tissue?'

Doel: behoud van ledematen buiten het lichaam optimaliseren 

- spieren hebben korte ischemie tijd --> het snelst aangetast

HE: morphologisch, cell-diameter, necrotische cellen

-> kost veel tijd en niet sensitief genoeg?

NADH: irregulaire verdeling van oxidative metabole enzymen --> spierschade

MAC: membrane attack complex neoantigenen --> kleuren necrotische cellen

onderzoeksvraag:

How can ischemia reperfusion related alterations be reduced in muscle tissue?

Subresearch question A:

Can ischemia reperfusion related alterations be decreased/minimalized in muscle tissue with extracorporeal perfusion?

Subresearch question B:

How can ischemia reperfusion related alterations be visualized in muscle tissue and be optimized in a grading-system?

Methode

• n=8 SCS, n=8 ECP
• Bloedgas, EMG, ICG, gewicht
• Oogsten  >  flush (HTK) > SCS/ECP > replantatie > 7-daagse follow-up

Histologie: biopten

• Formaline: HE
• HISS-score: oedeem, inflammatie, heterogeniteit, cel schade
• Snap-freeze: NADH/MAC

flexor

extensor

HISS-scoringssysteem

-Baseline, na interventie, POD 1-3-7

-NADH: intensiteit en myofibrillaire architectuur

-HISS: 1 tot 12 > mate van spierschade, nog maken/bepalen voor NADH & MAC

Resultaten

• SCS n=2 en ECP n=2 geëxcludeerd POD7
• MAC: negatief m.u.v. R6 & R9 > onbruikbaar

HISS: 

• Hoger in de ECP groep
• Piek op POD 3 
• POD3  (p=0.110) 
• POD7 (p= 0.008)
• max. verschil van 1,9 punt
• Significant verschil oedeem  (p< 0.001)

Subscores op POD 7

Categorieën

Geexcludeerd:  

-artiële/veneuze trombus

-gescheurde arterie

Subscores:

- Opvallend is dat de spiercellen van de ECP varkens vooral hoger scoren op oedeem (dit verschil is ook significant)

Resultaten

NADH: 

• Vanaf POD 3 hoger in ECP groep 
• POD 3 (p = 0.203)
• POD 7 (p = 0.310)
• max. verschil van 0,2 -> niet significant

Statistiek:

• Overeenstemming NADH/HISS laag
• Overeenstemming beoordelaars goed

NADH-scoringssysteem

Voorbeeld

- Geen duidelijk patroon

Weighted kappa NADH/HISS categorieën= 0.06

> HISS laat vaker schade zien dan NADH, terwijl dit omgekeerd bijna nooit het geval is. 

> Er gaat data verloren omdat je met categoriëen werkt. Je middelt eerst de 2 spiergroepen waarna je de score indeelt in een categorie

Discussie

• Hogere ECP score niet klinisch relevant
• Andere dierstudies

• Limitaties: sample size en gevoeligheid vriesbiopten 
• Toekomst: follow-up verlengen (regeneratie), HE voor vaten/zenuw, HE + immunohisto kleuring (transplant)
  

HE

HE:

• €50 per batch
• Kan mee met patiënten materiaal (sneller)
• Inzicht in subscores
• Bewaren bij kamertemp.

NADH

NADH:

• €338 per batch
• Duurt 4 uur per batch
• Gespecialiseerde analist nodig
• Bewaren bij -80°C

MAC

MAC:

• €590 per batch
• Duurt 7 uur per batch
• Gespecialiseerde analist nodig
• Bewaren bij -80°C

HE

- afhankelijk van de vloeistof, beter met bloed

- lastig vergelijken, vanwege verschil scoringssystemen

NADH 

- alleen rat studies

- varken meer natuurlijke reducingagents? NAD+ -> NADH

MAC

- alleen (post-mortem) studies op mensen met spierafwijkingen

- verschil in neoantigenen

Niet klinisch relevant want de gemiddelde scores vallen beiden (SCS vs ECP) nog steeds onder 'no to minimal damage' of nét onder intermediate damage --> misschien zal dit nog wel zakken bij een langere follow-up (omdat de daling-trend dan doorzet?)

dierstudies:

- HE: vergelijkbaar met andere varkensstudies, betere uitkomsten als er bloed wordt gebruikt. Lastig te vergelijken vanwege verschil in scoringssystemen (alhoewel hier ook vooral toename van oedeem)

- NADH: alleen rat-studies gevonden, waar je een toename zag van spierschade die NADH kon aantonen

-MAC: alleen (post-mortem) studies gevonden die necrotische cellen bij mensen met een spierafwijking kunnen aantonen. Heel weinig onderzoek bekent over ischemie/reperfusie schade aantonen met MAC

Toekomst:

- follow-up tijd verlengen zodat je de regeneratie kan volgen -> neemt het nog meer af na 7 dagen?

- HE kan ook gebruikt worden om bloedvaten/zenuwen te kleuren (handig voor als deze in de follow up ook teruggezet worden)

- HE kan in combinatie gebruikt worden met imunnohistologische kleuringen (PECAM, F4/80, Ly66 ) om de immunogeniteit te bepalen van de te transplanteren poot

Conclusie

• 24h-ECP zorgt voor een minimale toename in spierschade t.o.v. SCS
• Geen correlatie
• Follow-up met  HE-kleuring
• MAC en NADH niet sensitief genoeg

Geen correlatie tussen de 3 methodes

HE is goedkoper, sneller en gebruiksvriendelijker