PCR 5BCT - les 1

• Biotechniek
• Secundair onderwijs

PCR - techniek

• materiaalkennis

• bereidingen en oplossingen

• werkingsprincipes

09.04.01 

De leerlingen leggen principes van biotechnologische en chemische technieken uit.

• kloneren, PCR, DNA-sequencing

• spectroscopie, chromatografie, volumetrie

Welke base paren komen voor in DNA

1. Adenine-Uracil Cytosine-Thymine
2. Adenine-Thymine Cytosine-Guanine
3. Adenine-Thymine Guanine-Uracil
4. Adenine-Uracil Cytosine-Guanine

Nucleotide is een...

1. Stikstofbase + fosforgroep
2. Stikstofbase + suikergroep
3. Stikstofbase + suiker +fosforgroep
4. Stikstofbase

5'-posities kunnen fosfaatgroepen binden. 

Op de 3'-posities kunnen de hydroxylgroepen van de suiker binden.

3' => 5' = Sense

5' => 3' = Antisense

3'

3'

5'

5'

Met de term menselijk genoom bedoelt men het geheel aan erfelijke informatie in één enkele cel uit het menselijk lichaam. Zo'n cel bevat 46 chromosomen (22 paren + 2 geslachtschromosomen), voor een totaal van ongeveer
....... baseparen (bp) aan DNA.

1. 3,2biljoen (3.200.000.000.000)
2. 3,2miljard (3.200.000.000)
3. 3,2miljoen (3.000.000)
4. 3,2honderduizend (320.000)

133.000.000.000.000 = 133 Biljoen

gemarmerde longvis

Waarom wil men DNA analyseren?

Wat is er nodig voor de PCR-techniek uit te voeren?
Benodigdheden?

* origineel DNA = Target DNA - Doelwit DNA - Template DNA

* Buffer (optimale pH)  + MgCl₂

* Taq DNA-Polymerase of kortweg Taq-Polymerase

* Primers

* dNTP - desoxyribonucleosidetrifosfaat (= DNA-basen = nucleotide)

desoxyadenosinetrifosfaat (dATP), desoxyguanosinetrifosfaat (dGTP), desoxythymidinetrifosfaat (dTTP) en desoxycytidinetrifosfaat (dCTP)

PCR

Benodigdheden

* Denaturatie - 95°C

* Hybridisatie/annealing/renaturatie - 40-60°C

* DNA-synthese/polymerisatie/primer-extensie - 72°C-95°C

Stap 1: Denaturatie

- de dubbele helix vorm van het DNA wordt verbroken

- 95°C gedurende 15s tot 2 minuten

- de H-bruggen tussen de basen verbreken, difosforesterverbindigen worden niet beschadigd.

 

Stap 2: Hybridisatie/ annealing/ renaturatie

 - twee primers, elke primer hecht aan één specifieke streng:

  sense primer (of forward primer) die hecht aan de 3’ -> 5’ – streng 

  antisense primer (of reverse primer) aan de 5’ -> 3’ – streng 

- 40-60 °C (deze lagere temperatuur is nodig zodat de primers niet inactief zouden worden)

- maximum 1 minuut

 

Waar moet een primer
aan voldoen?

Primer

een basensequentie die complementair is aan de basen die aan de twee uiteinden van het te vermenigvuldigen DNA-fragment

* 20-30 nucleotiden

* Niet complementair aan elkaar

* Zo specifiek dat het maar op 1 gen past en zodus vermeerderd

Stap 3: DNA-synthese/ polymerisatie/ primerextentie

- aanhechten van complementaire dNTP op de DNA-enkelstrengen

- enzym Taq DNA-polymerase: optimumtemperatuur 72°C, stabiel tot 95°C

(thermus aquaticus)

- polymerisatie in de  5’ - 3’-richting 

(Soms is de temperatuur van annealing en polymerisatie dezelfde en kan dit dus in één stap uitgevoerd worden) 

 

Controle?

Gel-elektroforese

* Start materiaal = Target = originele DNA streng

* DNA amplificeren om te kunnen analyseren

* Controle: positief/negatieve controle

* Controle van de primers met target DNA

=> gel elektroforese

Wat is de functie van PCR
Polymerase Chain Reaction
Polymerasekettingreactie

1. De lengte van een DNA streng bepalen
2. de volgorde bepalen van de DNA baseparen
3. Target DNA vergelijken met gekende samples
4. Vermeerderen van een specifiek stuk uit target DNA

https://wet.kuleuven.be/wetenschapinbreedbeeld/lesmateriaal_biologie/lespakket2005/humangenomeproject

https://www.eoswetenschap.eu/technologie/de-steile-opmars-van-pcr

https://www.kwrwater.nl/onderzoek/enabling-technologies/hydrogenomica/

1

2

3

Welke toepassingen vind je terug in deze tekst?

Beschrijf kort de toepassing en de functie/meerwaarde van PCR.

4

Toepassing PCR - eigen artikel zoeken

Wetenschappelijk correct artikel, betrouwbare bron

Welke toepassingen vond je terug in de artikels?

Kan je zomaar elk stuk DNA amplificeren
met de PCR techniek?

1. JA, geen voorwaarden
2. NEE, verschillende beperkingen
3. JA, mits de juiste primers
4. NEE, enkel DNA van mensen en dieren

Benoem de 3 stappen in de polymerase ketenreactie

Wat is essentieel om voor genetische modificatie een specifiek stuk gen uit een DNA keten te kunnen amplificeren

qPCR - kwantitatieve PCR - RT PCR - Real Time PCR 

SYBR-green

Quencher-Reporter

PROBE