PCR en Sequencing

• Biologie
• Middelbare school
• vwo
• Leerjaar 6

Doel

Je kunt uitleggen voor welk doel PCR gebruikt kan worden om DNA te kopiëren of te sequensen.

Gebaseerd op wat je weet van replicatie, welke stoffen heb je dan allemaal nodig om DNA te kopieren in een eppendorf (rechts)

Verschillen met replicatie

	Replicatie	PCR
verbreken H-bruggen	helicase	verhitten tot 95C
primer	RNA	DNA
plakken okazaki fragment	ligase	er zijn 3 leidende strengen
Verlengen	DNA polymerase	DNA polymerase

3'ACTGGGCCGATTCAAGCTTAAACCGGGTTCATTGACTAA5'

5'TGACCCGGCTAAGTTCGAATTTGGCCCAAGTAACTGATT3'

sleep de juiste primer naar de juiste plek op het DNA

3'CGGCTAAG5'

5'TCATTGAC3'

3'ACTGGGCCGATTCAAGCTTAAACCGGGTTCATTGACTAA5'

5'TGACCCGGCTAAGTTCGAATTTGGCCCAAGTAACTGATT3'

neem de bovenste streng over en verleng vanaf de primer in de juiste richting

CGGCTAAG

DNA polymerase

5'TCATTGAC3'

Stappen PCR

Denaturatie: verbreken H-bruggen tussen DNA strengen  (95C)

Hybridisatie: Binden DNA primers aan DNA-streng (54C)

Verlengen: Bouwen complementaire DNAketens door DNA polymerase (72

C)

herhaal stappen +- 30 keer

vragen

1) DNA polymerase is een enzym, welk probleem verwacht je bij hoge temperaturen? 

2) Voor een goede denaturatie bij 95C mogen de primers niet te veel C en G bevatten. Hoe hoger het percentage C en G hoe hoger de denaturatie-temperatuur. Verklaar

3) Welk effect zou de lengte van de primer hebben op de Denaturatie-temperatuur?

vulkanische bron

Thermophilus aquaticus

Taq-polymerase

DNA polymerase uit T. aquaticus

optimum bij 72C 

bereken hoeveel kopieën van een DNA-fragment gemaakt zijn na 30 cycli.

Van PCR naar sequensen

Hoe kan met PCR techniek de basenvolgorde van DNA bepaald worden?

naast normale nucleotiden  worden ook speciale nucleotiden toegevoegd die vanaf het inbouwen de verlenging blokkeren.

ddATP

di-deoxy ...

Normaal dATP

deoxyribose adenine trifosfaat

5'ACTGGGCCGATTCAAGCTTAAACCGGGTTCATTGACTAA3'

hoeveel verschillende fragmenten kan ik krijgen als ik ddATP toevoeg aan de mix? Welke lengtes hebben deze?

CGGCTAAG

DNA gelelectroforese

zichtbaar maken

1. ethidiumbromide + UV
2. radioactief label 
3. fluorescent label 

opdracht

kolom 1: mix met ddATP

kolom 2 mix met ddGTP

kolom 3: mix met ddCTP

kolom 4:mix met ddTTP

wat is de volgorde van het gesequenste DNAfragment?

als het goed is

TGCACTTGAACGCATGCT

(van klein naar groot gewerkt)

huiswerk

19.3

(transformatie doen we na hoofdstuk 20)