DNA isolatie/knippen en electroforese

• Biologie
• MBO
• Studiejaar 2

DNA practica

Isolatie, knippen en electroforese

Isolatie

Welke barrières moet je doorbreken om bij het DNA te komen?

Hoe haal je het DNA uit de oplossing?

Celwand afbreken met lysozym

1

Celmembraan afbreken met zeep

2

Met ijskoude ethanol 96% laat je het DNA neerslaan

Knippen

Doel: kleinere stukken maken zodat ze te scheiden zijn bij elektroforese

Knippen met behulp van              

Restrictie-enzymen (HinDIII)

Restrictie-site

De plaats waar het restrictie-enzym gaat knippen

Faag DNA

48.490 basparen lang

Door HinDIII op 7 plekken geknipt               8 DNA fragmenten

Bacteriofaag

Een virus dat een bacterie kan infecteren.

Knipmix

Buffer

Zorgt voor een optimale pH voor de restrictie-enzymen

HinDIII

Het restrictie-enzym dat we gebruiken om het DNA te knippen.

MilliQ water

Om de juiste verdunning te krijgen en genoeg volume om te pipetteren.

Monster 1

DNA van de bacterie toevoegen aan de E. coli knipmix

Monster 2

Faag DNA uit de bacteriofaag aan de faag knipmix toevoegen.

Electroforese

Doel: DNA fragmenten scheiden op basis van grootte en lading.

Benodigdheden:

1. Agarosegel werkt als filter, poriegrootte afhankelijk van de concentratie.
2. Gelred wordt aan de gel toegevoegd, dit hecht aan het DNA en licht op met UV licht.
3. Electroforesebak met TAE bufferoplossing: geleidt de stroom en houdt de pH constant

Monster voorbereiding

                                    toevoegen aan de DNA monsters:

1. Verzwaren van het DNA zodat het in de slotjes zakt.
2. Geeft het DNA een blauwe kleur zodat het zichtbaar is met het blote oog.

Sample buffer

Ook wel Loading buffer of Loading dye genoemd

Electroforese

DNA is negatief geladen en zal richting de positieve pool migreren.

Kleinere fragmenten kunnen sneller en makkelijker door de poriën in de agarose gel en komen verder.

Fragmenten van gelijke grootte 

vormen een "bandje" in de gel.

Verwachtingen

Bacterie DNA

Deze strengen zijn te groot om te electroforeren, zelfs na knippen met HinDIII. Ze blijven in het slotje en migreren niet de agar in.

1

Faag DNA

Het faag DNA is in 8 fragmenten geknipt door HinDIII. Je verwacht dus 8 bandjes te zien.

2