ELISA

• ELISA
• MBO
• Studiejaar 3

Antistoffen en ELISA techniek

Antigeen

Antilichaam

Een stof die in staat is een immunologische reactie op te roepen

Ander woord voor Immunoglobulinen  of antistof

In de wand van B-lymfocyten of los in de lichaamvloeistoffen

Wat zijn antilichamen?

Wat: Eiwitten
Functie: Bescherming
Productie: Immuunsysteem (B cellen)
Hoe: Door te binden en zo stoffen onschadelijk te maken.
Andere naam: Immunoglobuline

Wat zijn antigenen?

Een antigeen is een lichaamsvreemde stof die het lichaam binnen is gedrongen. 

Dat kan zijn: bacterie, virus, schimmel, allergenen, giftige stoffen.

Antilichamen worden specifiek geproduceerd om deze aan te vallen.

Bouw van een antilichaam

Vorm = functie!
Basisbouw = zelfde!

Bouw van een antilichaam

Variabel deel = specifiek!
Constante deel = altijd hetzelde!

Epitopen

De paratoop van de antistof bindt het epitoop van een antigeen

Paratopen vs Epitopen

Meer paratopen is meer bindingen met epitopen. 

ELISA techniek

"Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay"

Het is een test (assay) waarin een antistof reageert op een antigeen dat gebonden is aan een plastic oppervlak (sorbent). 

Om die reactie zichtbaar te maken wordt er een enzym gebruikt dat een kleur kan opwekken. 

ELISA techniek

De ELISA techniek is dus een methode om bijvoorbeeld antistoffen in bloedmonsters/serum/melk/... aan te tonen. 

De methode is makkelijk uit te voeren en makkelijk te automatiseren. Ook is ze heel specifiek voor de antigenen/stoffen die je wil testen. 

Directe ELISA
Stap 1

In een 96 wells plaat word de bodem van de wells gecoat met antigenen van een virus. Bijvoorbeeld antigenen van het Corona virus.

Dit antigeen zit dus nu vast aan de bodem van de plaat. 

Directe ELISA
Stap 1 vervolg

Een analist voegt sample toe van de patiënt, bijvoorbeeld bloed of serum.

Antistoffen die de patiënt heeft aangemaakt tegen het virus zullen zich nu kunnen binden aan de antigenen op de bodem van de plaat. 

Er vormt zich nu een primair antilichaam conjugaat (binding/connectie) tussen het antigeen en de antistof. 

Directe ELISA
Stap 2 Wassen

Nadat er een conjugaat is ontstaan zal de analist de wells wassen met een wasvloeistof. 

Alles wat niet gebonden is zal daardoor uit de wells weggespoeld worden!

Directe ELISA
Stap 3 Kleurreactie

Het conjugaat van antigeen-antistof heeft nog een extra onderdeel bij ELISA. 

Dit onderdeel heet Horseradishperoxidase (HRP) en wordt in de afbeelding weergegeven als "E". Dit enzym is gebonden aan het antilichaam.

Directe ELISA
Stap 3 Kleurreactie

Het enzym (HRP) kan tetramethylbenzidine (TMB) omzetten. Hierdoor wordt de kleurloze oplossing in de wel blauw-groen. 

Na afloop kan de analist de extinctie meten om een uitspraak te kunnen doen over de kleurontwikkeling. 
Ook kan een analist een verdunningsreeks opzetten om zo de concentratie antigenen te bepalen in het patiëntensample! 

Waarom is wassen tussen bepaalde stappen zo belangrijk?

Hoe heten het meest gebruikte enzym en substraat?

Hoe donkerder het blauw, hoe...

Indirecte ELISA
Stap 1

In een 96 wells plaat word de bodem van de wells gecoat met antigenen van een virus. Bijvoorbeeld antigenen van het Corona virus.

Dit antigeen zit dus nu vast aan de bodem van de plaat. 

Indirecte ELISA
Stap 1 vervolg

Een analist voegt sample toe van de patiënt, bijvoorbeeld bloed of serum.

Antistoffen die de patiënt heeft aangemaakt tegen het virus zullen zich nu kunnen binden aan de antigenen op de bodem van de plaat. 

Er vormt zich nu een binding tussen het antigeen en de antistof. Antistoffen tegen andere antigenen blijven in de oplossing!

Directe ELISA
Stap 2 Wassen

Nadat er een binding is ontstaan zal de analist de wells wassen met een wasvloeistof. 

Alles wat niet gebonden is zal daardoor uit de wells weggespoeld worden!

In de wells zitten antistof 1 en het antigeen nu gebonden op de bodem.

Indirecte ELISA
Stap 3 

De analist voegt nu een oplossing toe met een tweede antistof die bindt aan antistof 1. 

Antistof 2 heeft een enzym gebonden dat kleur kan omzetten, bijvoorbeeld (HRP)

Als gevolg zal er NU PAS een conjugaat ontstaat tussen antistof 1 en antostof 2. 

Indirecte ELISA
Stap 4 

Na nog een wasstap zullen het antigeen, antistof 1 en het secundair antilichaam conjugaat overblijven op de bodem van de well.

De analist zal nu een substraat toevoegen dat omgezet kan worden naar een kleur door het enzym dat gebonden zit aan antistof 2. 

Bijvoorbeeld HRP zet TMB om van kleurloos naar blauw. 

Kun je uitleggen waarom '2 antilichamen een voordeel kan zijn?

1. Waarom is het tweede antilichaam mouse anti-human?
2. Wat is hier het voordeel van?
3. Waar komt antilichaam 1 vandaan/mogelijk vandaan?

Samenvatting

Waarom zo veel moeite? 

Directe ELISA is sneller maar ook duurder omdat je maar 1 soort antilichaam hebt. Elk antilichaam moet daarom specifiek passen op het antigeen dat je wil testen. Wel heb je minder kans op fouten tijdens de procedure. 

Indirecte ELISA duurt langer maar is specifieker.
De 2 antilichamen werken als een soort extra controle voor je. 
Bijkomend is ook dat antilichaam 2 op alle antilichaam 1's in je voorraadkast zou kunnen passen. Daardoor heb je veel minder dure specifieke antilichamen nodig, meer flexibiliteit.

Als risico heeft de Indirecte ELISA meer kans op kruisreactiviteit (waarbij er reacties optreden met dingen die je niet wil testen). 

Samengevat 

Direct = snel, duur, weinig kans op fouten.

Indirect = langzamer, goedkoper, meer kans op kruisreactiviteit, meer flexibiliteit, meer specifiek, extra controle in gebouwd in test. 

Welke van deze
ELISA's is
indirect?

Welke van deze ELISA's is indirect?

1. Alleen de 1ste
2. Alleen de 2de
3. Beiden
4. Geen van beide

Wat gebruikt men bij een indirecte ELISA wel en bij een directe niet?

Voordelen directe ELISA

Voordelen indirecte ELISA

Snel

Minder kans op fouten in de procedure

Hoge sensitiviteit 

Economisch voordelig

Grote flexibiliteit