P2.3 Nucleïnezuren en tellen van mo

• Biologie
• MBO
• Studiejaar 2

Lesstof periode 2.3

Biologie leerjaar 2 N3

Tellen van micro-organismen hoofdstuk 13

• Directe en indirecte telling
• Groeicurven in vloeibare media

DNA

• Bouw van nucleïnezuren
  
• Moleculaire genetica
  
• Eiwitsynthese met transcriptie en translatie

H13.5 Het tellen van micro- organismen

• In de levensmiddelenindustrie telt men vaak het aantal bacteriën.
• Het aantal bacteriën zegt iets over de kwaliteit van het product.                 Bijvoorbeeld: Houdbaarheid, hygiëne
• Deze kwaliteitseisen zijn door de overheid vastgelegd. 
• 2 Methoden: 

Directe telling

Dit is de telling van het totaal aantal aanwezige bacteriën in een monster middels een telkamer. 

Het totaal wil zeggen:

Levende en dode bacteriën of kweekbare en niet kweekbare bacteriën.

Het is een snelle methode. 

Kolonietelling

Telling van alleen kweekbare bacteriën d.m.v. verdunnen en uitplaten van de bouillonkweek op vaste voedingsbodems. 

Dit wordt ook wel: Kiemgetalbepaling genoemd.

Deze methode duurt langer omdat er 24-72 uur geïncubeerd moet worden.  

Biologie leerjaar 2 N3

foutje in deze dia:

niet 0,004mm2 maar mm3!

per ml

H13.5 Kolonietelling

Methode 1: Spreidplaat

Berekening kiemgetal

Kolonies  *10 (omrekenfactor van 0,1ml naar 1 ml)  * Vf = KVE/ mL

KVE: kolonievormende eenheden

Biologie leerjaar 2 N3

de suspentie wordt op de plaat verspreid

Methode 2: Gietplaatmethode

Berekening kiemgetal

Kolonies  * Vf = KVE/ mL

Biologie leerjaar 2 N3

De suspentie wordt door de agar gemengd

Practicum 1a en 1b

Biologie leerjaar 2 N3

Maak de opdracht: "Tellen van micro-organismen" om te oefenen met de berekeningen.

Deze vind je in Cumlaude bij Biologie-Theorie 

H13.5 Het tellen van micro-organismen (Herhaling)

1. Directe telling 

Telt de levende en dode cellen in een suspensie m.b.v. een telkamer. 

-> Snelle methode

2. Kolonie telling 

Telt alleen kweekbare micro-organismen d.m.v. verdunnen en uitplaten op voedingsbodems.

-> Kiemgetalbepaling

Biologie leerjaar 2 N3

Verwijs naar de practica. 

Bekijk de feedback goed. 

Twee methode voor kiemgetal bepaling

Kiemgetal

Het aantal levende micro-organismen per mililiter of per gram.

1: 

Berekening: Kolonies * 10 * vf = KVE/mL

2: 

Berekening: Kolonies  * vf = KVE/mL

Spreidplaatmethode

Gietplaatmethode

Biologie leerjaar 2 N3

H13.6 Groeicurven in vloeibare media 

Biologie leerjaar 2 N3

H13.7 Exponentiële aantallen

n = 60/g 

Stel een MO deelt elke 20 minuten. Wat is dan de groeisnelheid (n)?

n = groeisnelheid in generaties/uur

g = delingstijd in minuten of uren

1 bacterie deelt elk half uur. Hoeveel zijn er na 5 uur?

g=30 minuten dus groeisnelheid(n)= 60/30=2 delingen per uur. In 5 uur zal de bacterie zich dus 5x2=10x delen. Na 5 uur zijn er dan 2^10 bacteriën

Als g=20min. n=60/20=3 delingen/uur

Biologie leerjaar 2 N3

Extra oefenen: 5 minuten

Vraag 1: 

Je hebt gistcellen geteld met de Bürker-Turk telkamer. Gemiddeld heb je 23,5 cellen geteld per vierkantje. Het vierkantje heeft een inhoud van 0,005 mm³. Hoeveel gistcellen zitten er in de oplossing per milliliter? Geef het antwoord in wetenschappelijke notatie?

Je wil weten hoeveel cellen er per ml inzitten. 1ml=1cm3=1000mm3

1 vierkantje is 0,005mm3, er passen dus 1000/0,005=200.000 vierkantjes in een ml. Gemiddeld zijn er 23,5 cellen in een vierkantje, dus zitten er gemiddeld 23,5 x 200.000= 4,7.10^6 cellen in een ml

Biologie leerjaar 2 N3

Hoeveel vierkantjes in 1 mm3?

1/0,005= 200 

En per 1 ml?

200 * 1000 = 200.000

23,5 * 200.000 = 4700000 = 4,7 *10E6 KVE/ml

Extra oefenen: 5 minuten

Vraag 2: 

Geef de groeicurve voor micro-organismen in een vloeibaar medium met de 4 fasen en leg uit wat bij de 4 fasen gebeurt.

Lagfase: cellen worden groter, maar delen niet

Logfase: exponentiële deling/toename van het aantal cellen

Stationaire fase: Er gaan evenveel cellen dood als dat er nieuwe bij komen.

Afstervingsfase: Cellen sterven af door tekort aan voedsel en ophoping van afvalstoffen.

Biologie leerjaar 2 N3

Extra oefenen: 5 minuten

Vraag 3:

De Streptococcus pneumoniae deelt elke 30 minuten. Aan het begin van de cultuur start je met 4 bacteriën. Hoeveel bacteriën heb je na 16 uur?

g=30 dus de generatietijd (n)=60/30=2 delingen/uur. In 16 uur zal elk van de 4 bacteriën dus 16x2=32 keer delen.  Na 16 uur zijn er dan 4x 2^32 bacteriën

Biologie leerjaar 2 N3

Voedingsmiddelen microbiologie

Biologie leerjaar 2 N3

Voedsel bevat                    en                       micro-organismen. 

Weet je nog het verschil tussen een                              en een                                             ?

Jullie gaan een gehakt monster onderzoeken bij exp 2.

1. Waar maak je gehakt van? Bevat dit al bacteriën?
2. Waar in het productieproces liggen de kritische stappen?
3. Waarom is gehakt vaker besmet dan bijvoorbeeld een biefstuk?
4. Wat moet je doen voordat je de verdunningsreeks kunt maken?

gewenste

Nuttige/functionele micro-organismen zoals gisten (bier, wijn, brood) en schimmels (kaas). 

ongewenste

Pathogene micro-organismen die bederf van het voedsel veroorzaken en ziekte bij de persoon die het binnenkrijgt.

Bijvoorbeeld: Salmonella, bepaalde E. coli stammen en Staphylococcus aureus

voedselvergiftiging

Je wordt ziek van de gifstoffen die het micro-organisme produceert.  Symptomen treden binnen 2 tot 6 uur op en gaan meestal gepaard met braken. Je bent er meestal binnen 1 dag weer vanaf.

voedselinfectie

Je wordt ziek van het micro-organisme zelf nadat het zich heeft vermenigvuldigd in je lichaam. Symtomen treden na 8-24 uur op in de vorm van buikklachten, koorts en diarree. Deze houden 1 tot 3 dagen aan.

Lees exp 2 door: Mesofiel aeroob kiemgetal

Wat betekent mesofiel?

Doel

                       kiemgetal bepalen in KVE/gram

Welke stappen voer je uit voor je het kiemgetal kunt berekenen?

Mesofiel

Met een optimumtemperatuur tussen de 20 en 37 graden Celcius

1. Maak een 1:10 verdunning in een stomacherzak (bij een vast monster)
2. Maak een decimale verdunningsreeks
3. Uitplaten in gietplaten
4. KVE tellen en kiemgetal berekenen in KVE/gram

Noem de kritische stappen bij het maken van de verdunningsreeks.

PCA platen

• Plate Count Agar
• Bevat verschillende nutriënten
• De meeste mo groeien hierop (niet -selectief) 

Betrouwbaarheid

Decimale verdunning?

Zie je de decimale verdunning terug in het aantal kolonies op de platen?

Aantal KVE

Bereken alleen een kiemgetal met platen tussen de 10-300 KVE.

Vergelijk met klasgenoten

Jullie hebben immers allemaal hetzelfde monster gekregen.

Verwachtingen

Voldoet de uitslag aan je verwachting?

Tips voor de voorbereiding

1. Maak een goede proef in beeld met tekeningen van het verdunnen van de stomacherzak en de decimale verdunningsreeks.
2. Laat in je PIB zien hoeveel je uit welke buis in welke plaat pipetteert. 

Meetrapport maken

• Gebruik het format in bijlage 1
• Noteer de monstergegevens 
• Vergelijk je conclusie met de microbiologische richtlijnen
• Let bij de discussie op de betrouwbaarheid
• Lever het in op Cumlaude

Indicator-organismen....

Biologie leerjaar 2 N3

wijzen op een zodanige toestand van het product dat de kans op pathogenen aanwezig is.

Bijvoorbeeld E. coli in drinkwater

Het pathogeen is vaak:

• Moeilijker te isoleren
• In kleinere hoeveelheden en in tussenpozen aanwezig

Wanneer E. coli aanwezig is, bestaat de mogelijkheid dat Salmonella ook aanwezig is. De redenering is dan dat er faecale besmetting is opgetreden, omdat E. coli een darmbacterie is. Beide bacteriën gebruiken namelijk dezelfde besmettingsweg.

Voorwaarden aan het indicatororganisme

Biologie leerjaar 2 N3

1. Zijn altijd in grote getale aanwezig wanneer het pathogeen aanwezig is.
2.  Hebben een vergelijkbare besmettingswijze, groei en afsterving als het pathogeen
3. Moet eenvoudig en snel aangetoond kunnen worden.

Lees Exp. 3: Enterobacteriaceae in water

Biologie leerjaar 2 N3

1. Wat is het doel? 
2. Welke 2 bepalingen moet je daarvoor doen? 
3. Geef per bepaling aan welk type micro-organismen je hiermee telt.
4. Leg uit a.d.h.v. de selectieve en electieve stoffen in VRBG hoe de kolonies van coliforme bacteriën eruit zien.

VRBG agar

Biologie leerjaar 2 N3

Violet Red Bile Glucose agar

Selectieve stoffen

• Kristalviolet en galzouten remmen Gram +

Electieve stoffen

• Glucose en neutraalrood

Glucosefermentatie>zure producten>pH daalt>rode kolonies door neutraalrood + evt neerslag van galzouten

5.6.1 Nucleotiden en 5.6.2 DNA

RNA

• 4 mogelijke stikstofbasen: 
• Uracil (U), Adenine (A), Guanine (G) en Cytosine (C)
• Het polymeer is 'enkelstrengs'. 
• Bevat ribose

• Nucleïnezuren ontstaan door polymerisatie van nucleotiden
• Polymerisatie middels 

Condensatie- reacties

Chemische reactie waarbij het polymeer ontstaat door aaneenschakeling van monomeren

Bij deze reactie komt water vrij. 

DNA

• 4 mogelijke stikstofbasen:  Thymine (T), Adenine (A), Guanine (G) en Cytosine (C)
• Bevat deoxiribose
• Het polymeer is 'dubbelstrengs'
• De basen A-T en G-C vormen 'Basenparen (bp)' 
• De 'treden' van de dubbele DNA wenteltrap.
• De dubbele strengen zijn 'complementair'. 

Biologie leerjaar 2 N3

Nucleotiden bestaan uit:

-een fosfaat groep

-een suiker (deoxyribose of ribose)

-een stikstofbase

Nucleinezuren zijn opgebouwd uit nucleotiden

12.1 en 12.2 Inleiding moleculaire genetica

Biologie leerjaar 2 N3

Nu gaan we de code op het DNA ontcijferen, zodat er een eiwit gemaakt kan worden. Dat gaat in meerdere stappen.

Biologie leerjaar 2 N3

Het DNA is opgedeeld in:

• Genen: stukken DNA die coderen voor eiwitten
  
• Junk DNA: stukken DNA die nergens voor coderen voor zover we weten
  

Introns en extrons zijn hier buiten beschouwing gelaten omdat dit ook niet in het boek aan bod komt en mogelijk ook te ver voert voor N3 studenten.

Biologie leerjaar 2 N3

Al ons DNA ligt opgeslagen in de celkern opgerold tot chromosomen. Elk chromosoom bestaat uit 1 DNA molecuul.

Exp 4: DNA isolatie

Biologie leerjaar 2 N3

Prokaryoten hebben één chromosoom en verschillende plasmiden

1. Welke barrières moet je doorbreken om bij het DNA te komen?
2. Hoe doe je dat bij exp. 4?
3. Hoe scheid je het DNA van de                                  rest?

Exp 5: Knippen van DNA

Biologie leerjaar 2 N3

Restrictie enzymen knippen DNA op . 

Jullie gaan                      knippen met het HinDIII restrictie enzym.

Elk restrictie enzym knipt DNA op een plek met een specifieke basensequentie (volgorde). Deze sequentie komt in grote stukken DNA vaak meerdere keren voor. Het enzym zal dan ook meerdere keren knippen.

λ faag DNA

DNA van een virus (bacteriofaag) dat bacteriën kan infecteren. Dit stuk DNA is 48.490 baseparen lang.

specifieke plekken

dit noemen we ook wel restrictie sites. Dit zijn plekken op het DNA met een specifieke basenvolgorde.

Lees exp. 5 door en beantwoord de vragen.

Biologie leerjaar 2 N3

HinDIII knipt het λ faag DNA op 7 plekken.

1. Hoeveel fragmenten blijven er over na het knippen?
2. Zoek op internet, uit hoeveel baseparen deze fragmenten bestaan. 
3. Waar moet je rekening mee houden wanneer je met enzymen werkt?

Voorbereiding electroforese

Biologie leerjaar 2 N3

Voordat je kunt elektroforeren moet je een agarose gel gieten. Deze zorgt voor:

• Het scheiden van de DNA fragmenten op grootte. De poriën in de gel werken hierbij als filter.
• Het zichtbaar kunnen maken van DNA onder UV licht door toevoeging van                   aan de agarose.

Gelred

Stof die zich bindt aan DNA en oplicht bij aanstraling door UV licht.           LET OP: gebruik handschoenen bij het hanteren, het hecht ook aan je eigen DNA!

DNA electroforese

Biologie leerjaar 2 N3

Het scheiden van het DNA op basis van grootte en lading. 

• De concentratie van de gel bepaalt de grootte van de poriën. Grote fragmenten gaan dus langzamer door de gel dan kleine fragmenten.
• DNA is negatief geladen bij een pH van 8,3 en zal dus richting de                        bewegen.

anode

positieve pool

Monster voorbereiding

Biologie leerjaar 2 N3

2 doelen:

1. Kleuren van het monster zodat het DNA front met het blote oog zichtbaar is tijdens de elektroforese.
2. Verzwaren van het monster zodat het in het slotje zakt en niet diffundeert in de TAE buffer

Loading dye

Ook wel sample buffer of loading buffer genoemd. 

-Heeft een blauwe kleur die tijdens de electroforese meeloopt met de kleine  DNA fragmenten. Je weet dan wanneer je moet stoppen, voordat de fragmenten aan het einde van de gel zijn.

-Verzwaard het monster zodat deze niet gaat diffunderen, en netjes in het slotje zakt door de TAE buffer heen.

Lees exp. 7 door en beantwoord de vragen.

Biologie leerjaar 2 N3

1. De Loading dye is 6x geconcentreerd. Hiervan voeg je 4 μl toe aan 20 μl van je DNA-monster. Hoe vaak heb je de loading dye nu verdund?
2. Wat is de functie van de TAE waarmee de hele bak wordt gevuld?
3. Aan welke kant van de bak komen de slotjes?
4. Zoek op wat een baseparenladder is.
5. Zoek het verwachtte bandenpatroon op van het geknipte λ faag DNA na elektroforese.

Het begin van de eiwitsynthese: transciptie

Biologie leerjaar 2 N3

Stap 1

Stap 1: De cel krijgt een seintje dat er een eiwit gemaakt moet worden.

Stap 3

Transcriptie begint: Het "vertalen" van het gen in het DNA naar een mRNA streng. 

Stap 2

Het benodigde gen wordt geactiveerd

12.3.1 Transcriptie

Biologie leerjaar 2 N3

Een gen begint altijd met de 

Het enzym                              bindt zich aan de promotor en zorgt ervoor dat RNA nucleotiden zich kunnen binden aan het DNA door basenparing. De RNA streng die is ontstaan heet 

promotor

Een bepaalde nulceotidenvolgorde

RNA-polymerase

Enzym dat de waterstofbruggen verbreekt tussen de DNA ketens en zich hecht aan de promotor. 

m-RNA

Het vervolg van de eiwitsynthese: translatie

Biologie leerjaar 2 N3

Stap 4

Het m-RNA verlaat de kern via de kernporiën en gaat naar het cytoplasma. 

Stap 5

Het m-RNA bindt aan een ribosoom en het ribosoom start de translatie

Stap 6

Wanneer het eiwit klaar is laat het ribosoom de m-RNA streng en het eiwit los. Het eiwit wordt vervoerd naar de plek waar het nodig is. 

aminozuur

Code op het mRNA ontcijferen

Biologie leerjaar 2 N3

• Eiwitten zijn opgebouwd uit aminozuren.
• Het m-RNA bevat                  waarmee de aminozuurvolgorde van het te maken eiwit afgelezen kan worden.

codons

Groepjes van 3 nucleotiden in met messenger RNA die coderen voor een aminozuur. Zo'n groepje wordt ook wel triplet genoemd.

Codons aflezen

Biologie leerjaar 2 N3

• Er zijn 4³=64 verschillende tripletten/codons mogelijk
• Er zijn 20 verschillende aminozuren
• Startcodon: codeert ook voor het aminozuur methionine
  
• 3 stopcodons: coderen niet voor een aminozuur
  

In de tabel op pagina 250 zie je de codering voor de aminozuren.

Wat is de code voor het startcodon?

Wat zijn de drie codes voor de stopcodons?

Aangezien er meer codons dan aminozuren zijn, coderen meerdere codons voor hetzelfde aminozuur!

Ribosomen

Biologie leerjaar 2 N3

Het zijn de ribosomen in het cytoplasma en op het RER (ruig endoplasmatisch reticulum) die het mRNA vertalen naar een eiwit door per codon de juiste aminozuren aan elkaar te koppelen. Dit noemen we translatie

Ribosomaal RNA= rRNA

Biologie leerjaar 2 N3

Ribosomen zijn opgebouwd uit een groot en een klein deel.

Deze delen zijn gemaakt van rRNA wat verpakt is in eiwit. 

Samen vormen ze het ribosoom en lezen ze de codons van het mRNA af.

Transport RNA= tRNA

Biologie leerjaar 2 N3

Vervoert een aminozuur naar het ribosoom en heeft een aparte vorm door basenparing in dezelfde tRNA keten. Hierdoor ontstaan:

• Drie lussen waarvan 1 lus met 3 ongepaarde nucleotiden= anticodon
  
• Vrije bindingsplaats (drie ongepaarde nucleotiden CCA)= bindingsplaats voor 1 specifiek aminozuur

tRNA

Biologie leerjaar 2 N3

• Het anticodon kan met het mRNA binden
  
• Er zijn 61 verschillende tRNA moleculen
• De drie stopcodons coderen niet voor een aminozuur
• Wanneer het aminozuur gekoppeld is laat het tRNA weer los

www.bioplek.org

Korte herhaling

Biologie leerjaar 2 N3

• Welke typen RNA zijn er?
  
• Waarvoor dient elk type?
  
• Wat is transcriptie?
  
• Wat is een codon?
  
• Wat is een anti-codon?