BIOP 2020- 2021

• Biologie
• MBO
• Studiejaar 2

Praktijk periode 2

    2 hoofdlijnen

• TK 6: Op basis van de Alkalische fosfatase bepaling AF1 en AF2
• TK 7: Op basis van AF3
• TK 8: Op basis van Alkalische fosfatase en glucose
• Kennismaken met DNA -technieken in de praktijk

                           DNA isoleren uit thymus en zuiverheid bepalen

                           DNA digesteren en electroforeren 

Op te leveren producten vanuit Digibib

• Glucose: VB, MR en Rapportage met controlekaart           (TK7b TK8a en 8c)  
• AF 1: VB, MR 
• AF 1: TK6a 
• AF 2: VB op basis van TK6a  en uitwerking volgens TK6c
• AF 3: TK 7a en 7b, TK 8a en 8c

H6.1: Inleiding enzymen

enzym

Substraat

De stof die omgezet wordt in een (bio)chemische reactie

Product

De stoffen die ontstaan bij een (bio)chemische reactie

Deze slide is gewoon een algemeen plaatje. 

• Even aangeven dat de cartoon een chemische reactie is. 
• Dat het enzym de omzetting mogelijk maakt en zelf niet wordt verbruikt = katalysator
• Dan gelijk naar de volgende slide met filmpje.

Activeringsenergie

• Om een reactie te laten verlopen is energie nodig (rood)
• Een katalysator verlaagd deze hoeveelheid energie (blauw)
• Daardoor verloopt de reactie makkelijker en dus sneller. 

Wederom samenvatten: 

• Een katalysator verlaagd de activeringsenergie
• De reactie verloopt daardoor makkelijker en sneller
• Worden zelf niet verbruikt
• In de biologie heten deze katalysatoren ENZYMEN genoemd

6.2: Werking van enzymen

Wat zijn enzymen:

• Eiwitten (zie H5.4)
  
• Bezitten een ruimtelijke structuur (vouwing; H5.4.4)
  
• Deze structuur is van groot belang voor de werking
  
• Zijn biologisch actief: Versnellen een biochemische reactie
  
• Worden zelf niet verbruikt tijdens de reactie
• Hebben een co-factor/ enzym nodig om goed te kunnen werken

Co-factor of co-enzym

• Is een hulpstof die bijdraagt aan de juiste ruimtelijke structuur van het enzym (eiwit).
• Meestal zijn dit vitaminen of metaal-ionen 

(micro-nutriënten H14.3.2)

6.3: Invloed van de temp. op enzymen

Algemeen:

Als de temperatuur stijgt, gaan reacties sneller 

• Maar is dit bij enzymen ook het geval? 

Namen van ingelogde studenten komen in het wiel te staan. 

Door te draaien krijgt iemand een beurt om antwoord te geven op de vraag. 

Bij verhoging van de temperatuur stijgt de reactiesnelheid, maar niet onbeperkt. Leg uit. 

Minimumtemperatuur

De laagste temp. waarbij het enzym nog actief is

Optimumtemperatuur

Is de temp. functioneerd het enzym het best. 

Maximumtemperatuur

De hoogste temp. waarbij een enzym nog actief is. Boven deze temp. is het enzym niet meer actief. Eiwitten denatureren bij hoge temp. 

Verwijs eventueel naar de praktijk. 

6.4: Invloed van de zuurgraad op enzymen

Eiwitten: 

• Hebben een ruimtelijke structuur.
• Wordt bepaald door de rangschikking van de aminozuren
• De zuurgraad heeft invloed op de restgroepen
• Dus ook op de ruimtelijke structuur en de activiteit van het enzym

Verwijs eventueel op de praktijk

Invloed van de zuurgraad op het enzym  vergelijkbaar met de invloed van de temperatuur op het enzym

Optimale omstandigheden voor enzymen

• In ons lichaam is 37C de optimale temp voor de enzymen

• Het optimum voor de pH is bij elk enzym verschillend

• Dit hangt voornamelijk af van de locatie in het lichaam

Na slide 48 opgave 9 t/m 17 pagina 116 en 117

Alkalische fosfatase (AF)

Op basis van ingeleverde producten

• Activiteit vs concentratie
• Berekeningen: Betrouwbaarheidsinterval Bijlage 7 
• Resultaten: tabellen staat een voorbeeld op pagina 7
• Opstellen ijklijn: Rekenvel is ter ondersteuning. 
• Trekken van conclusies

Betrouwbaarheidsinterval

Bijlage 7 praktijkbundel

Activiteits vs concentratie

De activiteit van een enzym wordt uitgedrukt in units per liter (U/l). Eén U/l komt overeen met een reactiesnelheid waarbij de productconcentratie per minuut met 1 µmol/l toeneemt.

Concentratie is een hoeveel stof opgelost in een vloeistof

Berekening ijklijn

Stockstandaard p-nitrofenol

Los 0,0940 g p-nitrofenol (0,75 mmol/l) op in 0,1M NaOH tot 1000ml. De standaard komt overeen met een AF activiteit van 5000U/L. 

Wat wil dit zeggen? 

Wat is p-nitrofenol in dit voorschrift? 

Hoe worden de assen van de ijlijn genoemd? 

Trekken van conclusies.

- Acceptabele bepalingsblanco? In dit voorschrift NVT. Waarom? 

- Acceptabele duploverschillen?

- Uitslag controlemonster valt in het betrouwbaarheidsinterval?

- R2 kalibratiecurve acceptabel (R2 > 0,995)?

Mogen de uitslagen worden doorgegeven?

Zie ook pagina 7

Conclusie na het nakijken van de Meetrapporten

Veel onnodige fouten door niet goed lezen

* Begrijpend lezen? 

* Veel nuttige aanwezig informatie gemist. 

  Die wel voorhanden was in het voorschrift

Samenwerking in de groep loopt niet goed.

TIP: Reserveer een moment waarop jullie elkaar treffen in teams. 

DNA technieken periode 6

• DNA islolatie Thymus, zuiverheids en concentratiebepaling
• DNA digestie (knippen) en agarosegel electroforese

Deze experimenten zullen door elkaar lopen. 

Belangrijk is om dit uit elkaar te houden. 

	DNA isolatie Kalfsthymus	DNA digestie en electroforese
Week 2.5	DNA isolatie	Gieten agarosegel
Week 2.7		Digestie inzetten
Week 2.8	Conc. + zuiverheid	Electroforese

Planning uitvoering DNA technieken periode 6

DNA isolatie uit kalfsthymus

Voorbehandeling

Analyse

Isolatie

UV- spectrofotometrie

Zuiverheid/ concentratie

Week 2.5

Week 2.8

DNA digestie en electroforese

Digestie

Electroforese

Voorbehandeling

Analyse

DNA isolatie uit kalfsthymus

Vraag 1: Waar in het protocol wordt zeep gebruikt? 

Vraag 2: Wanneer komt het DNA vrij? 

Vraag 3: Waar wordt dit door veroorzaakt? 

Vraag 4: Wat is de functie van TE-buffer? 

DNA digestie (knippen)

ʎ DNA

• Enzymen EcoRI  of HindIII

Restrictiemap

Electroforese patroon

Op een dergelijk wijze kan ook een voorspelling voor pUC19 gemaakt worden

DNA digestie mix berekening

ʎ DNA (0,33 µg/µl)	pUC19 (0,5µg/µl)
1µg DNA =..............µl 2µl 10x buffer 2µl enzym ?? µl AD=................µl	1µg DNA =..............µl 2µl 10x buffer 2µl enzym ?? µl AD=................µl
Totaal 20 µl	Totaal 20µl

Aandachtspunten inzetten digestie

• Pipetteren restrictie-enzymen 

• Restrictie-enzymen op ijs

• Labeling epjes 

Indien er geen antilichaam tegen het HbsAg aanwezig is, kan er geen substraat worden omgezet in een gekleurd product. 

ELISA: aantonen HbsAg antilichamen

Het HbsAg is een eiwit afkomstig van het hepatitis B virus. Als een persoon geinfecteerd geraakt met dit virus, dan zal deze persoon tegen dit lichaamsvreemde eiwit antistoffen aanmaken. 

Deze antistoffen kunnen ook worden aangetoond na vaccinatie tegen HepB. 

Aanpassingen voorschrift

Jullie krijgen geen 10% Tween-20, maar 100%.

Oorspronkelijk was:

0,5 ml 10% Tween-20 

PBS

Maak nu eerst een voorverdunning van 10% Tween-20

• Wasbuffer

Aanpassingen voorschrift

Jullie krijgen geen 100 g/L, maar 70 g/L

Oorspronkelijk was:

0,4 ml BSA (100 g/L) 

2 ml wasbuffer

Dit wordt: 0,6 ml BSA (70 g/L)

• Blockbuffer

2 ml wasbuffer

Digestie van Lambda DNA en pUC19 en Electroforese

ʎ DNA (0,33 µg/µl)	pUC19 (0,5µg/µl)
1µg DNA =..............µl 2µl 10x buffer 2µl enzym ?? µl AD=................µl	1µg DNA =..............µl 2µl 10x buffer 2µl enzym ?? µl AD=................µl
Totaal 20 µl	Totaal 20µl

DNA digestie en electroforese

Digestie

Electroforese

Voorbehandeling

Analyse

Concentratie bepalen en zuiverheid Thymus DNA

Concentratie

• Meting bij 260mn: UV spectrofotometrie/ speciale cuvetten

Zuiver DNA: extinctie van 1.000 komt overeen met 50ug/ ml

E=ϵ⋅l⋅c

Bereken de ϵ van zuiver DNA

ϵ=​c⋅l​​E​​

ϵ=​50​​1​​=0,02ug​−​​1⋅cm​−​​1⋅ml

Concentratie Thymus DNA

Bereken de concentratie 

c=​ϵ⋅l​​E​​

c=​0,02​​Egecorr​​⋅vf

Concentratie Thymus DNA

Welke vloeistof zit er in cuvet 1: Water

Welke vloeistof zit er in cuvet 2: TE

Welke vloeistof zit er in cuvet 5: Thymus DNA opgelost in TE

Welke vloeistof zit er in cuvet 3: Haring DNA opgelost in TE

Welke vloeistof zit er in cuvet 4: BSA opgelost in TE

Meten bij 260nm

Zuiverheid bepalen Thymus DNA

Welke vloeistof zit er in cuvet 1: Water

Welke vloeistof zit er in cuvet 2: TE

Welke vloeistof zit er in cuvet 3: Haring DNA opgelost in TE

Welke vloeistof zit er in cuvet 4: BSA opgelost in TE

Welke vloeistof zit er in cuvet 5: Thymus DNA opgelost in TE

Meten bij 280nm

Zuiverheid Thymus DNA

Bereken de zuiverheid 

Zuiver DNA: E260 gecorr/ E280 gecorr = 1,8

Zuiver RNA: E260 gecorr/ E280 gecorr = 2,0

Zuiver Eiwit: E260 gecorr/ E280 gecorr = 0,6 

ʎmax: nucleinezuren bij 260nm

ʎmax: eiwit bij 280nm

Waarmee wordt de betrouwbaarheid van deze meting gecontroleerd? 

1: 

2: 

Tip voor meetrapport: Denk goed na over de resultatentabel